組み換えPrPのNMR構造
大腸菌由来の組み換え(r)SHaPrP(90-231)のNMR構造は、タンパク質の精製およびリフォールディング後に特定された(図5A)。90～112残基に関してはこの領域で配座の不均一性が確認されたため明らかにならなっていないが、113～126残基は疎水性の保存領域であり、構造的な可塑性も示す(162)。rPrP(90-231)構造のいくつかの特徴は、小さいrMoPrP(121-231)フラグメントで過去に報告されたものと同様であるが(154,177)、十分な差異は確認されていない。たとえば、ヘリックスBのNH2端におけるループは、rPrP(90-231)で明確に定められているが、マウスPrP(121-231)では不規則である。さらに、ヘリックスCはrPrP(90-231)で200～227残基から成るが、マウスPrP(121-231)では200～217残基までしか伸びていない。ヘリックスCのループとCOOH末端部は、後述のタンパク質Xが結合する部位を形成することからとくに重要である(図5B)(178)。2つの組み換えPrPフラグメント間の差異の原因が、(i)異なる長さ、(ii)種に特異的な配列の相違、または(iii)構造解析の環境にあるのかは、依然として明らかになっていない。
キメラSHa/MoおよびHu/MoPrP導入遺伝子の試験では、PrPcがPrPScに結合する95～170残基のドメインが明らかとなった(133,179)。キメラウシ(Bo)/MoPrP導入遺伝子が、BSEプリオンに対するマウスの感受性を高めることができなかったため、我々はキメラおよび親のPrP遺伝子の配列における差異を調査した(180)。その結果、180～205残基のPrPで第二のドメインが明らかとなり、ここではPrPcとPrPScの相関を調節しているようであった(図5C)。MoPrP(23-231)およびSHaPrP(29-231)全体を対象とした最近のNMR試験では、NH2端は可動性が高く、実験環境下で特定可能な二次構造を欠くことが明らかとなった(図5D)(156,165)。SHaPrP(29-231)を対象とした試験結果は、「ヘリックスBのCOOH端」と、「可動性の高いNH2端のランダムコイル(8アミノ酸から成る反復配列を含む)」の間の一時的な相関を示している。MoPrP(23-231)の場合ではこのような相互作用が確認されていない(165)。
NMR structure of recombinant PrP.
The NMR structure of recombinant (r) SHaPrP(90–231) derived fromEscherichia coli was determined after the protein was purified and refolded (Fig. (Fig.55A). Residues 90–112 are not shown because marked conformational heterogeneity was found in this region, while residues 113–126 constitute the conserved hydrophobic region, which also displays some structural plasticity (162). Although some features of the structure of rPrP(90–231) are similar to those reported earlier for the smaller recombinant MoPrP(121–231) fragment (154, 177), substantial differences were found. For example, the loop at the NH2 terminus of helix B is well defined in rPrP(90–231) but is disordered in MoPrP(121–231); in addition, helix C is composed of residues 200–227 in rPrP(90–231) but extends only from 200–217 in MoPrP(121–231). The loop and the COOH-terminal portion of helix C are particularly important because they form the site to which protein X binds as described below (Fig. (Fig.55B) (178). Whether the differences between the two recombinant PrP fragments are because of (i) their different lengths, (ii) species-specific differences in sequences, or (iii) the conditions used for solving the structures remains to be determined.
Studies of chimeric SHa/Mo and Hu/Mo PrP transgenes identified a domain composed of residues 95–170, where PrPC binds to PrPSc (133, 179). When chimeric bovine (Bo)/Mo PrP transgenes failed to render mice sensitive to BSE prions, we examined the differences among the sequences in the chimeric and parent PrP genes (180). The findings identified a second domain in PrP composed of residues 180–205 that seems to modulate the interaction between PrPC and PrPSc (Fig. (Fig.55C).
Recent NMR studies of full-length MoPrP(23–231) and SHaPrP(29–231) have shown that the NH2 termini are highly flexible and lack identifiable secondary structure under the experimental conditions employed (Fig. (Fig.55D) (156, 165). Studies of SHaPrP(29–231) indicate transient interactions between the COOH terminus of helix B and the highly flexible, NH2-terminal random-coil containing the octareapeats (residues 29–125) (156); such interactions were not reported for MoPrP(23–231) (165).
